Prüfer, Barbara (1983): Untersuchungen zur Charakterisierung der toxischen Wirkung von Bacillus thuringiensis var. israelensis-Präparaten auf Xenopus laevis-Larven

Diplomarbeit

Die Arbeit hatte zum Ziel die bei einer Untersuchung zur Wirkung verschiedener B.t.i -Präparate auf Nicht-Ziel-Organismen überraschend festgestellte Wirkung auf Krallenfrosch-Larven (Xenopus laevis) sowie die Kaulquappen anderer Froschlurche (MORAWCSIK 1983) zu überprüfen. Dabei sollte geklärt werden:

1. warum B.t.i.-Präparate toxisch auf Anuren-Larven wirken,
2. welches dabei das eigentliche toxische Agens ist,
3. welcher Natur das Toxin sein könnte und
4. wie und wo es wirkt.

Für die Versuche wurden Kaulquappen unterschiedlichen Larvenalters des Krallenfrosches
Mortalitätstests unterworfen. Dabei kamen Konzentrationen der verwendeten
B.t.i.-Formulierungen von 1,8 mg/l bis 580 mg/l zur Anwendung.
Getestet wurden sechs Chargen von B.t.i.-Präparaten, die im Auftrag der Autorin
industriell hergestellt wurden (Aktivität zwischen 1.000 und 4.000 ITU/mg) sowie
die kommerziellen B.t.i.-Präparate TEKNAR 402 (1.000 ITU/mg), BACTIMOS (6.000
ITU/mg) und ABG (1.000 ITU/mg). Darüber hinaus wurden die Internationalen Pasteur-
Standards IPS 78 (1.000 ITU/mg) und IPS 80 (8.000 ITU/mg) getestet.
Mortalitätstests wurden an unterschiedlich alten Larven durchgeführt. Dabei wurden
die Larven unterschiedlich hohen Konzentrationen verschiedener B.t.i.-Lösung ausgesetzt.
Die Bestimmung der Mortalität erfolgte nach 24 Stunden.
Ein weiterer Mortalitätstest wurde an drei Tage alten Larven durchgeführt. Dabei
wurden diese Larven unterschiedlich langen Einwirkungszeiten einer B.t.i.-Lösung
von 180 mg/l ausgesetzt, bevor sie in Quellwasser weitergehältert wurden. Die Bestimmung
der Mortalität erfolgte nach 24 Stunden.

 

 

Wichtigste Ergebnisse:

Zunächst wurden Xenopus-Larven unterschiedlicher Altersklassen verschiedenen Konzentrationen des B.t.i.-Präparats BR 8102 (1.000 ITU/mg; Auftragsproduktion für das Testlabor) ausgesetzt. Es stellte sich heraus, dass die Krallenfroschlarven sensibel auf die Anwendung des B.t.i.-Präparats reagierten. Überraschend war, dass Larven in der ersten Woche nach dem Schlupf zunächst unempfindlich reagierten. Erst mit steigendem Alter nahm die Empfindlichkeit zu. Unabhängig von der Entwicklungsstufe starben die Larven jedoch, wenn die Konzentration des Präparats BR 8102 320 mg/l (entsprechend 320.000 ITU/l) erreichte.

Der Mortalitätstest an sehr jungen Larven erbrachte keine Sterblichkeit. Da sehr junge Larven von ihrem Dottervorrat leben und noch keine Nahrung aufnehmen, war bei dieser Altersklasse noch keine B.t.i.-Wirkung zu verzeichnen. Als Umkehrschluss wurde festgestellt, dass das für die Mortalität verantwortliche Toxin also peroral von den Larven aufgenommen werden musste, damit es wirken konnte.

Eine toxische Wirkung trat aber nur dann ein, wenn die Kaulquappen über längere Zeiträume den B.t.i.-Formulierungen ausgesetzt waren oder nach einer kurzen Expositionszeit, der eine Hälterung in klarem Wasser folgte. Konnten die Tiere nach zeitlich begrenzter Exposition weiter Nahrung aufnehmen, wurde keine erhöhte Mortalität beobachtet.

Die Mortalitätstests mit den verschiedenen B.t.i.-Präparaten ergab bei einer Konzentration von jeweils 180 mg/l sehr unterschiedliche Ergebnisse:

 

 

 

 

 

 

 

Aufgrund dieses äußerst heterogenen Ergebnisses kommt die Autorin zu dem Schluss, dass nicht der B.t.i.-Anteil in den Formulierungen für die beobachtete toxische Wirkung verantwortlich sein kann, sondern ein Agens, das aus der Fraktion der „inerten“ Zusatzstoffe stammen musste.

 

Um dieser Vermutung nachzugehen wurden B.t.i.-Kulturen getestet, die im Labor der Autorin selbst herangezüchtet wurden. Dabei wurde der B.t.i.-Stamm H14 A201 verwendet, der nach unterschiedlich langen Kulturzeiträumen (6, 9, 12, 15, 24 und 72 Stunden) „geerntet“ und in Konzentrationen von 18, 180, 320 und 580 mg/l getestet wurde.

Die Bestimmung der Xenopus-Mortalität nach 24 h zeigte, dass bei diesem Versuchs nur sehr geringe Mortalitätsraten auftraten. Die Bakterienkulturen erwiesen sich also als weitgehend nicht-toxisch für Xenopus-Larven. Da Tests gegen den Zielorganismus Aedes aegypti eine deutliche Wirkung belegten, folgerte die Autorin, dass bei den Kulturen nachweislich eine Produktion des B.t.i.-typischen δ-Endotoxins stattgefunden haben musste. Sie folgerte weiterhin, dass dieses δ-Endotoxin nicht ursächlich für die bei Xenopus beobachtete toxische Wirkung sein konnte.

 

In weiteren Versuchsansätzen versuchte die Autorin das toxische Agens zu charakterisieren. Auf diese Weise konnte eine mögliche Wirkung von Exotoxinen (Phospholipase- C, Hämolysin, Proteasen), die bei der Fermentation gebildet wurden, ausgeschlossen werden.

Letztendlich wurde für die Toxizität ein bislang unbekanntes Protein von B.t.i. verantwortlich gemacht, welches 20-40 kDa groß und hitzelabil ist. Als wahrscheinlichen Wirkungsort gibt die Autorin das Darmsystem an, wo es unter alkalischen Bedingungen herausgelöst und resorbiert wird. Als möglichen Angriffspunkt des Toxins nennt die Autorin die roten Blutkörperchen, wodurch bei den Kaulquappen eine Atmungshemmung hervorgerufen wird.

Die Autorin vermutet, dass das Toxin von B.t.i. nur unter bestimmten Fermentationsbedingungen gebildet wird, weil es in industriell hergestellten Chargen enthalten ist, in den Laborkulturen hingegen nicht. Sie schließt damit, dass dieses Toxin jedoch in so geringen Mengen gebildet wird, dass seine Wirkung bei der praktischen Anwendung vernachlässigt werden kann, da eine Wirkung gegen Kaulquappen erst ab einer gegenüber dem Feldeinsatz dreifach erhöhten Aufwandmenge zu erwarten sei.